32Pおよび33Pオルトリン酸標識

目次

実験概要
主な準備物
製品とカタログ番号
プロトコル概要
引用文献

 


 

 

実験概要

細胞ベースの放射性リン酸化アッセイは、細胞に32Pまたは33Pを供給するために、リン酸を含まない培地を使用します。通常、放射性標識されたリン酸(P)は、ATPではなく、オルトリン酸(Pi)の形で供給されます(細胞にATPを供給するのは難しいため)。

標的とする基質のリン酸化の同定は、通常免疫沈降と、SDS-PAGE、オートラジオグラフィーまたはリン光イメージングによって行われます。他の基質抽出および検出方法でも可能です。

 

主な準備物

32Piまたは33Pi(オルトリン酸)

・細胞

・リン酸フリー培地

・免疫沈降カラムと試薬

・ゲル電気泳動試薬および機器

・オートラジオグラフィー用フィルム(リン光イメージャーを使用しない場合)

・必要に応じて、フィルム現像剤、またはリン光イメージャー等

 

製品とカタログ番号

放射性標識されたオルトリン酸およびリン酸塩

Product Isotope Diluent Specific activity
(/mmol)
Rad. conc. Cat. number
Orthophosphoric acid (orthophosphate), carrier-free     32P    Water    314-337 TBq   Depends on size ordered – packaged in 1 mL water, no matter size NEX053
370 MBq/mL NEX053H
5.55 GBq/mL NEX053S
32P Water 33.3-40.7 GBq Varies depending on amount of radioactivity ordered – packaged in 1 mL water, no matter size NEX011
Disodium phosphate 32P Water 314-337 TBq Varies depending on amount of radioactivity ordered – packaged in 1 mL water, no matter size NEX060
Monopotassium phosphate

 

上記の製品を選択するにあたって:
ほとんどのプロトコルは、リン酸塩ではなくオルトリン酸を使用します。プロトコルでキャリアフリーの32Pが必要な場合は、例えばパーキンエルマー社製品のNEX053 / NEX053H / NEX053Sを使用してください。

 

プロトコル概要

 

引用文献

Cooke, F.T. Measurement of phosphoinositide 3-kinase products in cultured Mammalian cells by HPLC. Methods Mol. Biol 645, 179-202 (2010).

Foltyn, V.N., Zehl, M., Dikopoltsev, E., Jensen, O.N. & Wolosker, H. Phosphorylation of mouse serine racemase regulates D-serine synthesis. FEBS Lett 584, 2937-2941 (2010). 

Neddermann, P. NS5A phosphorylation and hyperphosphorylation. Methods Mol. Biol 510, 95-110 (2009). 

Strachan, R.T. et al. Ribosomal S6 kinase 2 directly phosphorylates the 5-hydroxytryptamine 2A (5-HT2A) serotonin receptor, thereby modulating 5-HT2A signaling. J. Biol. Chem 284, 5557-5573 (2009).