目次
実験概要
主な準備物
製品とカタログ番号
プロトコル概要
引用文献
実験概要
細胞ベースの放射性リン酸化アッセイは、細胞に32Pまたは33Pを供給するために、リン酸を含まない培地を使用します。通常、放射性標識されたリン酸(P)は、ATPではなく、オルトリン酸(Pi)の形で供給されます(細胞にATPを供給するのは難しいため)。
標的とする基質のリン酸化の同定は、通常免疫沈降と、SDS-PAGE、オートラジオグラフィーまたはリン光イメージングによって行われます。他の基質抽出および検出方法でも可能です。
主な準備物
・32Piまたは33Pi(オルトリン酸)
・細胞
・リン酸フリー培地
・免疫沈降カラムと試薬
・ゲル電気泳動試薬および機器
・オートラジオグラフィー用フィルム(リン光イメージャーを使用しない場合)
・必要に応じて、フィルム現像剤、またはリン光イメージャー等
製品とカタログ番号
放射性標識されたオルトリン酸およびリン酸塩
Product | Isotope | Diluent | Specific activity (/mmol) |
Rad. conc. | Cat. number |
Orthophosphoric acid (orthophosphate), carrier-free | 32P | Water | 314-337 TBq | Depends on size ordered – packaged in 1 mL water, no matter size | NEX053 |
370 MBq/mL | NEX053H | ||||
5.55 GBq/mL | NEX053S | ||||
32P | Water | 33.3-40.7 GBq | Varies depending on amount of radioactivity ordered – packaged in 1 mL water, no matter size | NEX011 | |
Disodium phosphate | 32P | Water | 314-337 TBq | Varies depending on amount of radioactivity ordered – packaged in 1 mL water, no matter size | NEX060 |
Monopotassium phosphate |
上記の製品を選択するにあたって:
ほとんどのプロトコルは、リン酸塩ではなくオルトリン酸を使用します。プロトコルでキャリアフリーの32Pが必要な場合は、例えばパーキンエルマー社製品のNEX053 / NEX053H / NEX053Sを使用してください。
プロトコル概要
引用文献
Neddermann, P. NS5A phosphorylation and hyperphosphorylation. Methods Mol. Biol 510, 95-110 (2009).