アセチルCoAを使用したアセチル化アッセイ

目次

実験概要
主な準備物
製品とカタログ番号
プロトコル概要
引用文献
実験のヒント

 

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実験概要

³Hおよび¹⁴C-アセチルCoAは、ヒストンおよびその他のタンパク質のin vitroアセチル化を研究するために使用される放射性標識基質です。

アセチル化は通常、タンパク質やペプチドのN末端、またはタンパク質内のリジン残基で起こります。また、アセチル化の実験は、³H標識酢酸ナトリウムを使用することも可能です。脱アセチル化アッセイ用の放射性基質は、放射性標識酢酸塩を使用します。

ヒストンのリジン残基のアセチル化と脱アセチル化は、エピジェネティックな調節に重要な役割を果たします。アセチル化は負電荷を与え、ヒストンの正電荷を中和し、負に帯電したDNAの結合を減らします。これによりクロマチン構造が緩み、転写に関わる分子群がDNAにアクセスできるようになります。ヒストンのアセチル化状態は、2つの酵素（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）とヒストンデアセチラーゼ（HDAC））によってバランスが保たれています。HATおよびHDACは、ヒストンタンパク質以外のものをアセチル化および脱アセチル化することもできます。

 

アセチル-CoAの標識を使用したアセチル化

 

主な準備物

 

標準的なin vitroアセチル化アッセイ

・³Hまたは¹⁴C標識アセチルCoA

・基質

・アセチルトランスフェラーゼ酵素

・非標識アセチルCoA*

・ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のゲル、バッファー**

・オートラジオグラフィーフィルムと現像液

*非標識のアセチルCoAを使用して、放射性標識化合物の比放射能を低下させ、反応中のアセチルCoAのモル濃度を増加させることができます。

**ゲル電気泳動以外にも、Whatman P81ペーパーで分離し、カクテルを加えた後、液体シンチレーションカウンタで測定も可能です。

 

ハイスループットFlashPlate in vitroアセチル化アッセイ

・³Hまたは¹⁴C標識アセチルCoA

・FlashPlate*またはストレプトアビジンコーティングされたFlashPlate

・基質

・アセチルトランスフェラーゼ酵素（HAT）

・非標識アセチルCoA

*FlashPlateの代替として、SPAストレプトアビジンコーティングビーズも利用可能

 

細胞ベースのアセチル化アッセイ

・³Hまたは¹⁴C標識酢酸ナトリウム

・細胞

・培養液

・洗浄バッファー

・精製、溶解または抽出試薬

・液体シンチレーションカウンタ、オートラジオグラフィー、ホスホイメージャー用の試薬

 

製品とカタログ番号

Chemical	Radioisotope	Labeling	Specific activity (/mmol)	Rad. conc. (/mL)	Solvent	Storage	Cat. number
Acetyl-CoA	3H	acetyl-1	37 – 370 GBq	3.7 MBq	Packaged under nitrogen in 0.01 M sodium acetate pH 5	-20°C	NET290
	14C	acetyl-1	1.48 – 2.22 GBq	740 kBq	Packaged under nitrogen in 0.01 M sodium acetate pH 5	-20°C	NEC313
Sodium acetate (acetic acid, sodium salt)	14C	(position 1)	1.85 – 2.29 GBq	7.4 MBq	Steri-packaged, aqueous solution	2-8°C	NEC084A
		(position 1)	1.67 – 2.22 GBq	37 MBq	Ethanol	2-8°C	NEC084H
		(positions 1,2)	1.67 – 2.22 GBq	3.7 MBq	Ethanol	-20°C	NEC553
		(position 2)	1.67 – 2.22 GBq	37 MBq	Ethanol	2-8°C	NEC085H

 

上記の表から放射化学物質を選択するために

 

化合物：
放射性標識アセチルCoAは酵素アッセイなどの生化学的アッセイに、放射性標識された酢酸ナトリウムは、細胞ベースのアッセイに使用されます。

 

放射性同位元素：
¹⁴Cまたは³Hのいずれかをアセチル化アッセイに使用します。¹⁴Cは³Hに比べてエネルギーが高いため、¹⁴Cは、液体シンチレーション計測においても³Hと比較して効率が高くなります。

 

溶媒：
エタノールが添加されている放射性標識化合物はより安定しています。
エタノールは細胞毒性を示す可能性があるため、細胞標識実験では、使用前にエタノールを蒸発させる必要がある場合があります。

 

比放射能：
比放射能が高いほど、アセチルCoAまたは酢酸分子あたりの放射能量が多くなります。

 

プロトコル概要

 

 

 

 

 

引用文献

 

標準的なアセチル化アッセイ

Pradeepa, M.M. et al. Acetylation of Transition Protein 2 (TP2) by KAT3B (p300) Alters Its DNA Condensation Property and Interaction with Putative Histone Chaperone NPM3. Journal of Biological Chemistry 284:, 29956 -29967 (2009).

Stimson, L. et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Mol. Cancer Ther 4, 1521-1532 (2005).

Lau, O.D. et al. p300/CBP-associated Factor Histone Acetyltransferase Processing of a Peptide Substrate: KINETIC ANALYSIS OF THE CATALYTIC MECHANISM. Journal of Biological Chemistry 275, 21953-21959 (2000).

Herrera, J.E., Bergel, M., Yang, X., Nakatani, Y. & Bustin, M. The Histone Acetyltransferase Activity of Human GCN5 and PCAF Is Stabilized by Coenzymes. Journal of Biological Chemistry 272, 27253-27258 (1997).

 

FlashPlateを用いたアセチル化アッセイ

Stimson, L. et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Mol. Cancer Ther 4, 1521-1532 (2005).

Wynne Aherne, G., Rowlands, M.G., Stimson, L. & Workman, P. Assays for the identification and evaluation of histone acetyltransferase inhibitors. Methods 26, 245-253 (2002).

Turlais, F. et al. High-throughput screening for identification of small molecule inhibitors of histone acetyltransferases using scintillating microplates (FlashPlate). Anal. Biochem 298, 62-68 (2001).

 

細胞ベースのアセチル化アッセイ

Guo, C., Mi, J., Brautigan, D.L. & Larner, J.M. ATM regulates ionizing radiation-induced disruption of HDAC1:PP1:Rb complexes. Cell. Signal 19, 504-510 (2007).

Kraker, A.J. et al. Modulation of Histone Acetylation by [4-(Acetylamino)-N-(2-Amino-phenyl) Benzamide] in HCT-8 Colon Carcinoma. Molecular Cancer Therapeutics 2, 401-408 (2003).

Verdin, E. et al. Measurement of Mammalian Histone Deacetylase Activity. Chromatin and Chromatin Remodeling Enzymes, Part C Volume 377, 180-196 (2003).

 

実験のヒント

これまでの文献は、ヒストンがFlashPlateの表面に付着する可能性があることを示唆しています。したがって、FlashPlateを用いる場合は、基質、³H標識アセチルCoA、酵素を一度に混合し、インキュベートしてから測定するオプションがあります。この場合、FlashPlateのプレコーティングは必要ありません。

アセチルCoAは不安定ですので、加水分解を防ぐことも必要になります。また、非標識アセチル-CoAの調製は粉末からフレッシュなものを使用するのがよいでしょう。